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    　　2016年，10x Genomics公司推出ChromiumTM系統(tǒng)，這是一套分子條形碼和分析系統(tǒng)，由儀器、試劑盒和信息學(xué)軟件組成，能夠?qū)覫llumina測序儀。

    　　腺相關(guān)病毒( AAV )因其二進(jìn)制生命周期而被識別，其有效復(fù)制依賴于與腺病毒( Ad )的共同感染，并且AAV潛伏期是在沒有輔助病毒的情況下建立的。從潛伏期到Ad依賴性AAV復(fù)制的轉(zhuǎn)變主要是在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)節(jié)的。目前的AAV轉(zhuǎn)錄本顯示了當(dāng)與Ad共同感染時(shí)發(fā)現(xiàn)的高度表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本。到目前為止，AAV轉(zhuǎn)錄物僅在AAV單鏈DNA基因組的陽性鏈上被鑒定。假設(shè)AAV負(fù)鏈沒有被轉(zhuǎn)錄。

    　　來自Charité醫(yī)學(xué)院的研究人員，德國應(yīng)用基于Illumina的RNA測序(RNA-Seq)在Ad存在或不存在的情況下表征整個(gè)AAV2轉(zhuǎn)錄組。他們發(fā)現(xiàn)已知和鑒定的新型AAV轉(zhuǎn)錄物，包括額外的剪接變體，其中導(dǎo)致新的18-kDa Rep / VP混合蛋白的表達(dá)。此外，實(shí)驗(yàn)研究人員發(fā)現(xiàn)AAV負(fù)鏈上的轉(zhuǎn)錄在p5啟動子上游具有聚集讀數(shù)，通過cDNA末端的5'快速擴(kuò)增和RNase保護(hù)測定證實(shí)。p5啟動子在兩個(gè)方向上顯示出相當(dāng)大的活??性，這是發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄不同的發(fā)現(xiàn)。在單獨(dú)用AAV感染后，兩種AAV鏈的低水平轉(zhuǎn)錄是可檢測的并且在用Ad共感染時(shí)強(qiáng)烈刺激。

    　　新一代測序(NGS)允許對轉(zhuǎn)錄譜進(jìn)行無偏的全基因組分析，此處用于在潛伏期和生產(chǎn)性感染期間對AAV2轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行深入分析。單細(xì)胞RNA-Seq測序分析導(dǎo)致發(fā)現(xiàn)新的AAV轉(zhuǎn)錄物和剪接變體，包括衍生的新型18-kDa Rep / VP混合蛋白。出乎意料的是，發(fā)現(xiàn)了來自AAV負(fù)鏈的轉(zhuǎn)錄，表明來自p5啟動子的不同轉(zhuǎn)錄。這一發(fā)現(xiàn)為AAV延遲和高效復(fù)制之間切換的新概念打開了大門。在沒有合適的動物模型來研究體內(nèi)AAV的情況下，結(jié)合細(xì)胞和計(jì)算機(jī)研究將有助于推進(jìn)對獨(dú)特的二分AAV生命周期的理解。

    　　RNA-Seq：AAV2基因組的兩條鏈上的作圖和轉(zhuǎn)錄分析。

    　　(A)AAV2特異性RNA-Seq的覆蓋圖譜在27hpi時(shí)讀取AAV2 / Ad2-共感染細(xì)胞的AAV2基因組。AAV2基因組量表顯示在中心。

    　　映射到正鏈的讀數(shù)如上所示，映射到負(fù)鏈的讀數(shù)如下所示。(B)如圖A中所示。呈現(xiàn)27hpi的AAV2感染細(xì)胞的RNA-Seq讀數(shù)。注意圖A和B中讀數(shù)計(jì)數(shù)的不同比例。(C)RNA-Seq讀數(shù)的映射以poly(A)尾結(jié)束。相對于AAV2 / Ad2-共感染細(xì)胞的數(shù)據(jù)集中多腺苷酸化AAV讀數(shù)的總和顯示poly(A)添加的基因組位置。(D)反向AAV2 p5區(qū)的啟動子活性。上部顯示AAV2基因組，其具有p5，p19和p40啟動子的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的核苷酸位置(黑色箭頭)。(E)AAV的5RACE分析減去鏈轉(zhuǎn)錄。顯示來自AAV負(fù)鏈(核苷酸330至170)的克隆5RACE產(chǎn)物的DNA序列的TSS(箭頭)。單個(gè)TSS在基因組上方顯示為黑色方塊。顯示AAV正鏈上的第287位(灰色箭頭)處的p5啟動子TSS的取向。(F)用有義方向覆蓋AAV2 170至250(左側(cè)部分)或AAV2 170至340(右側(cè)部分)的體外轉(zhuǎn)錄雜交探針進(jìn)行RNase保護(hù)測定，以檢測總AAV減去鏈轉(zhuǎn)錄物來自HeLa細(xì)胞的RNA模擬感染，AAV2感染，Ad2感染或AAV2 / Ad2共感染27小時(shí)。單個(gè)TSS在基因組上方顯示為黑色方塊。顯示AAV正鏈上的第287位(灰色箭頭)處的p5啟動子TSS的取向。(F)用有義方向覆蓋AAV2 170至250(左側(cè)部分)或AAV2 170至340(右側(cè)部分)的體外轉(zhuǎn)錄雜交探針進(jìn)行RNase保護(hù)測定，以檢測總AAV減去鏈轉(zhuǎn)錄物來自HeLa細(xì)胞的RNA模擬感染，AAV2感染，Ad2感染或AAV2 / Ad2共感染27小時(shí)。

    　　單個(gè)TSS在基因組上方顯示為黑色方塊。顯示AAV正鏈上的第287位(灰色箭頭)處的p5啟動子TSS的取向。(F)用有義方向覆蓋AAV2 170至250(左側(cè)部分)或AAV2 170至340(右側(cè)部分)的體外轉(zhuǎn)錄雜交探針進(jìn)行RNase保護(hù)測定，以檢測總AAV減去鏈轉(zhuǎn)錄物來自HeLa細(xì)胞的RNA模擬感染，AAV2感染，Ad2感染或AAV2 / Ad2共感染27小時(shí)。

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