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　　想要流式的染色結(jié)果好，需要用單細(xì)胞懸液，細(xì)胞團(tuán)和細(xì)胞碎片容易堵塞進(jìn)樣管。從固態(tài)組織樣本中制備單細(xì)胞懸液需要借助機(jī)械分離和(或者)酶消化。操作條件和酶的選擇等需要根據(jù)經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行一定的調(diào)整。以下是將四種常見的流式樣本制備成單細(xì)胞懸液的方法

　　一：組織培養(yǎng)細(xì)胞

　　 所需試劑器皿：

　　1、 Accutase酶 (eBioscience Cat#00-4555)

　　2、 流式染色緩沖液(eBioscience Cat#00-4222)

　　3、 15或50ml離心管

　　  單細(xì)胞懸液制備實(shí)驗(yàn)步驟：

　　1、 對(duì)于懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至離心管中，進(jìn)行計(jì)數(shù)和活力分析后進(jìn)入第3步;

　　2、 對(duì)于貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞系，我們建議用Accutase酶將細(xì)胞從培養(yǎng)皿中消化下來并分離聚集細(xì)胞。將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至離心管中進(jìn)行計(jì)數(shù)和活力分析后進(jìn)入第3步(注意：Accutase酶會(huì)改變某些細(xì)胞的表面抗原表位);

　　3、 離心后，將細(xì)胞用流式染色緩沖液重懸至細(xì)胞濃度為2*10^7/ml。

　　二、淋巴組織細(xì)胞

　　一般來說機(jī)械分離淋巴組織足夠?qū)⒓?xì)胞釋放為單細(xì)胞懸液。

　     單細(xì)胞懸液制備所需試劑器皿：

　　1、60mm×15mm的組織培養(yǎng)皿

　　2、3ml注射器

　　3、細(xì)胞過濾器(尼龍濾網(wǎng))

　　4、流式染色緩沖液(eBioscience Cat#00-4222)

　　5、15或50ml離心管

　　單細(xì)胞懸液制備實(shí)驗(yàn)步驟：

　　1、 將獲得的組織(脾臟、淋巴結(jié)、胸腺)放入到組織培養(yǎng)皿中，用3ml注射器活塞加壓的方法把組織分散為單細(xì)胞懸液(或者可以在10ml流式染色緩沖液總用兩片載玻片把組織壓成糊狀);

　　2、 用10ml流式染色緩沖液收集細(xì)胞，并將細(xì)胞懸液通過過濾器以除去細(xì)胞團(tuán)和細(xì)胞碎片。將懸液收集到離心管中;

　　3、 4℃，300-400g離心細(xì)胞懸液4-5min，去除上清液;

　　4、 重懸沉淀細(xì)胞并做計(jì)數(shù)和活力分析;

　　5、 重復(fù)步驟3后，將細(xì)胞用流式染色緩沖液重懸至細(xì)胞濃度為2*10^7/ml。

　　三、非淋巴組織細(xì)胞

　　  所需試劑器皿：

　　1、 剪刀或手術(shù)刀片

　　2、 PBS或其他合適的生理緩沖液

　　3、 60mm×15mm的組織培養(yǎng)皿

　　4、 3ml注射器

　　5、 細(xì)胞過濾器(尼龍濾網(wǎng))

　　6、 流式染色緩沖液(eBioscience Cat#00-4222)

　　7、 15或50ml離心管

　　  單細(xì)胞懸液制備實(shí)驗(yàn)步驟：

　　1、 將組織用剪刀或手術(shù)刀片弄成2-4mm大小的碎塊;

　　2、 加入用PBS稀釋的適量的酶，應(yīng)用合適孵育的時(shí)間和溫度參考所用酶的操作說明書(注意：酶的種類取決于組織的類型;

　　3、 用移液槍輕輕吹打分散細(xì)胞后，用過濾器過濾除去細(xì)胞團(tuán)和碎片，收集細(xì)胞懸液至離心管中;

　　4、 4℃，300-400g離心細(xì)胞懸液4-5min，去除上清液;

　　5、 用PBS重懸細(xì)胞，去除多余的酶溶液;

　　6、 按步驟4的方法離心;

　　7、 重復(fù)步驟5和6;

　　8、 用流式染色緩沖液重懸細(xì)胞，并進(jìn)行計(jì)數(shù)和活力分析;

　　9、 按步驟4的方法離心，將細(xì)胞用流式染色緩沖液重懸至細(xì)胞濃度為2*10^7/ml。

　　四、從全血中分離PBMC

　　 所需試劑器皿：

　　1、 PBS

　　2、 Ficoll或者其他密度梯度分離液

　　3、 流式染色緩沖液(eBioscience Cat#00-4222)

　　4、 15或50ml離心管

　　  單細(xì)胞懸液制備實(shí)驗(yàn)步驟：

　　1、 將全血用PBS 1:1在錐形管中稀釋;

　　2、 在稀釋的樣本上面加入等體積的Ficoll;

　　3、 1000g離心20min;

　　4、 將位于PBS和Ficoll層間的PBMC轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的管中;

　　5、 加入PBS清洗細(xì)胞;

　　6、 4℃，300-400g離心細(xì)胞懸液4-5min，去除上清液;

　　7、 用流式染色緩沖液重懸沉淀細(xì)胞并做計(jì)數(shù)和活力分析;

　　8、 重復(fù)步驟6后，將細(xì)胞用流式染色緩沖液重懸至細(xì)胞濃度為2*10^7/ml。