1.1什么是單細(xì)胞測序
單細(xì)胞全轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)是在單細(xì)胞水平對全轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行擴增與測序的一項新技術(shù)。通過對單個細(xì)胞的mRNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴增，使用高通量測序手段，對單細(xì)胞中mRNA進(jìn)行基因表達(dá)定量、功能富集、代謝通路分析等分析，從而解決早期胚胎發(fā)育、干細(xì)胞、癌癥、免疫等領(lǐng)域中存在的起始樣本量較低或細(xì)胞異質(zhì)性的問題，并展開研究。
1.2產(chǎn)品功能
單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)主要用于在全基因組范圍內(nèi)挖掘基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，尤其適用于存在高度異質(zhì)性的干細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞及胚胎發(fā)育早期的細(xì)胞群體。單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析有助于深入理解細(xì)胞分化、細(xì)胞重編程及轉(zhuǎn)分化等過程及相關(guān)的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。
1.3技術(shù)優(yōu)勢
近年來，已有多種單細(xì)胞測序技術(shù)及平臺應(yīng)用而生，10x Genomics憑借其高細(xì)胞通量、短項目周期及低成本脫穎而出。
1 超短建庫時間 從細(xì)胞懸液到cDNA文庫僅需1天
2 高細(xì)胞通量，可一次捕獲數(shù)萬個細(xì)胞；
3 高捕獲效率 單細(xì)胞捕獲效率高達(dá)65%；
4 單個細(xì)胞
5 價格優(yōu)惠 相較于其他單細(xì)胞平臺，價格大幅優(yōu)惠。
1.4實驗簡介
1.4.1實驗原理
基于10×Genomics平臺，通過快速高效的單細(xì)胞標(biāo)記、測序和分析，獲得單細(xì)胞水平的數(shù)字化基因表達(dá)譜，可對復(fù)雜細(xì)胞群體進(jìn)行深入細(xì)致分析，繪制單細(xì)胞表達(dá)圖譜。 應(yīng)用：這一技術(shù)可廣泛應(yīng)用于癌癥，免疫，干細(xì)胞，胚胎分化發(fā)育，神經(jīng)分化發(fā)育等研究，為疾病或遺傳發(fā)育等研究等提供了的良好機遇。
1.4.2 實驗流程
獲得樣品后，首先組織樣品要經(jīng)過研磨處理，將組織塊處理成單個細(xì)胞。其余樣本收集分裝，直接送測序。
1.5 項目執(zhí)行時間
從樣品的檢測合格開始，到建庫測序及數(shù)據(jù)分析出報告，大約需要30天：
從實驗啟動到送測序完成需要1個工作日，如果樣品需要進(jìn)行組織完整性鑒定，則額外需要3個工作日，共計4個工作日。前期質(zhì)檢結(jié)果我們會在第四個工作日之前以書面的形式通知銷售和科研助理。
二、樣本準(zhǔn)備
2.1 樣本要求
2.1.1 DNA
a. 片段>100kb（至少大于50k），總量>2.5μg
b. 客戶樣品、樣品完整信息單
c. 送樣前一天通知實驗人員，準(zhǔn)備時間進(jìn)行細(xì)胞處理
2.1.2組織樣本
a. 新鮮的組織 ，0.5g 以上
b. 客戶樣品、樣品完整信息單
c. 送樣前一天通知實驗人員，準(zhǔn)備時間進(jìn)行細(xì)胞處理
2.1.3血液樣本
a. 全血>400μl以上
b. 客戶樣品、樣品完整信息單
c. 送樣前一天通知實驗人員，準(zhǔn)備時間進(jìn)行細(xì)胞處理
2.1.4單細(xì)胞樣本
a. 總量> 6×10^5 個，細(xì)胞直徑< 30μm
b. 客戶樣品、樣品完整信息單
c. 送樣前一天通知實驗人員，準(zhǔn)備時間進(jìn)行細(xì)胞處理
三、樣本運輸
3.1樣品包裝：所有的容器應(yīng)當(dāng)用parafilm進(jìn)行封口
3.2 樣本標(biāo)識
在容器表面寫清樣品名稱，且與信息單上一致。不建議用油性筆直接在管壁或管蓋上寫樣品名稱等信息，將樣品名稱等 各種信息寫在標(biāo)簽紙上，貼在管壁，外面再用透明膠帶纏繞一圈(防止標(biāo)簽紙沒有粘牢脫落，導(dǎo)致 樣品無法應(yīng)用)。
3.3 樣本運輸條件
1、運輸過程中需要添加的干冰和冰袋的量與季節(jié)、運輸時間長短、泡沫盒的 薄厚有關(guān)(為更有利于保溫，盡量選用大塊的干冰，建議將樣品用透明膠固定于冰袋上，防止干冰揮發(fā)導(dǎo)致樣品降解)。
2、所有樣品盡量保證48小時內(nèi)運達(dá)。
3、銷售請于寄送前告知實驗室人員和科研助理，所有樣品不支持到付。
四、應(yīng)用案例
案例1 10x單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序應(yīng)用于小鼠腸道干細(xì)胞以研究不同群體間的關(guān)系
Yan K S, Gevaert O, Zheng G, et al. Intestinal Enteroendocrine Lineage Cells Possess Homeostatic and Injury-Inducible Stem Cell Activity. （Cell Stem Cell ,IF:23.393,2017）
腸道具有明顯的再生潛力，腸道干細(xì)胞（ISCs）位于增生性隱窩，可產(chǎn)生祖系細(xì)胞，這些祖細(xì)胞具有多譜系細(xì)胞分化、維持穩(wěn)態(tài)及創(chuàng)傷性再生的能力。作者對小鼠ISC群體進(jìn)行10x單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序以研究不同群體間的關(guān)系。結(jié)果顯示 multiple cycling ISC群體的轉(zhuǎn)錄組與 Lgr5+ISCs非常相似，但是Bmi1-GFP+細(xì)胞是不同的，含有豐富的內(nèi)分泌（EE）標(biāo)記，包括 Prox1。在體外Prox1-GFP+細(xì)胞會一直保持克隆生長，在體內(nèi)譜系追蹤結(jié)果顯示Prox1+細(xì)胞在穩(wěn)態(tài)維持和受到輻射損傷后會保持長期的克隆。細(xì)胞聚類分析將Prox1-GFP+細(xì)胞分成兩個亞群，一個與成熟內(nèi)分泌細(xì)胞（EE）類似，另一個的內(nèi)分泌基因表達(dá)水平較低但是卻與tuft細(xì)胞標(biāo)記基因（Lgr5、Ascl2）共表達(dá)。本研究數(shù)據(jù)顯示內(nèi)分泌譜系細(xì)胞，包括成熟內(nèi)分泌細(xì)胞，具有腸道干細(xì)胞活性。
案例2 10x單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序鑒定18787個人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的不同起始亞群
Single-Cell Transcriptome Sequencing Of 18,787 Human Induced Pluripotent Stem Cells Identifies Differentially Primed Subpopulations.（bioRxiv, 2017）
對于多功能細(xì)胞，轉(zhuǎn)錄表達(dá)譜是發(fā)現(xiàn)調(diào)控未分化狀態(tài)關(guān)鍵基因和基因網(wǎng)絡(luò)的中心。但是，對多能性細(xì)胞培養(yǎng)中體現(xiàn)出的細(xì)胞態(tài)異質(zhì)性并沒有轉(zhuǎn)錄水平上的描述。由于細(xì)胞間基因表達(dá)具有高度異質(zhì)性，單細(xì)胞RNA測序(scRNA-seq)可以用來加深我們對個體多能細(xì)胞功能的理解。本文作者通過10x 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序研究了18787個人WTC CRISPRi 人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。根據(jù)多能態(tài)，將人群分為四個亞群：靜止(48.3%)，增殖(47.8%)，分化早期(2%)，分化晚期(1.1%)。研究人員確定了為每個亞群定義的新基因和其通路，并且開發(fā)了一個多基因預(yù)測模型對單細(xì)胞進(jìn)行亞群分類。該研究為擴展對多能細(xì)胞復(fù)雜性的理解提供了一個基準(zhǔn)單細(xì)胞數(shù)據(jù)集。
案例3
Dissecting meiotic recombination based on tetrad analysis by single-microspore sequencing in maize. (Nature Communications, 2015)
遺傳重組是物種進(jìn)化的重要動力，而且作物遺傳改良中扮演重要的角色。四分體是一次細(xì)胞減數(shù)分裂后的直接產(chǎn)物，是遺傳重組分析的理想材料。分離四分體的四個小孢子機芯單細(xì)胞基因型分析是研究遺傳重組機制的方案。嚴(yán)建兵教授課題組分離了玉米四分體的四個小孢子，并進(jìn)行單細(xì)胞測序分析。通過重組分析顯示，基因區(qū)比基因間隔區(qū)更容易發(fā)生重組，而且在基因的5’和3’調(diào)控區(qū)重組發(fā)生更為常見。作者證明了植物中存在較強的重組負(fù)干涉和復(fù)雜的染色單體干涉以及環(huán)境因素能夠顯著影響重組頻率等重要的遺傳學(xué)現(xiàn)象。本研究對玉米重組規(guī)律有了新認(rèn)識，為作物遺傳育種提供了有價值的信息。
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