說(shuō)說(shuō)什么是單細(xì)胞測(cè)序（Single-cell sequencing）？普通測(cè)序所提取的RNA（或DNA）源于樣本中的多個(gè)細(xì)胞，所以普通測(cè)序的結(jié)果不可避免的會(huì)受到不同細(xì)胞間異質(zhì)性（Heterogeneity）的影響，而單細(xì)胞測(cè)序則是針對(duì)單個(gè)細(xì)胞的基因組進(jìn)行測(cè)序，能夠更好地幫助我們認(rèn)識(shí)細(xì)胞與細(xì)胞之間的差異。
肯定有童鞋要問(wèn)了，一個(gè)細(xì)胞里的DNA或RNA僅僅處在皮克（Picograms）級(jí)的水平，這么少的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到現(xiàn)有測(cè)序儀的上樣需求，那么單細(xì)胞測(cè)序要怎么搞？這就不得不提到全基因組擴(kuò)增（Whole-genome amplification，WGA）這項(xiàng)技術(shù)了，這項(xiàng)技術(shù)顧名思義，就是對(duì)全基因組進(jìn)行擴(kuò)增，目前主流上有三類方法（見(jiàn)下圖）。
PCR為基礎(chǔ)的擴(kuò)增方法，在擴(kuò)增的時(shí)候?qū)σ恍┨厥馕稽c(diǎn)可能會(huì)存在偏好，導(dǎo)致對(duì)整個(gè)基因組的覆蓋程度不夠。
以MDA（Multiple displacement amplification）為代表的等溫法雖然對(duì)基因組的覆蓋程度較好，但是一致性（Uniformity）較差。
而以謝曉亮（Sunney Xie）教授研發(fā)的多重退火和成環(huán)循環(huán)擴(kuò)增技術(shù)（Multiple Annealing and Looping-Based Amplification Cycles, MALBAC）為代表的混合法，在基因組的覆蓋程度和一致性上相比于前兩種方法處于中等。
從全基因組擴(kuò)增這一步來(lái)看，擴(kuò)增帶來(lái)的誤差會(huì)對(duì)全基因組測(cè)序的精度造成較大的影響。而實(shí)際上單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)上的挑戰(zhàn)遠(yuǎn)遠(yuǎn)不僅于此。從第一步細(xì)胞分離開(kāi)始，就需要較高的實(shí)驗(yàn)操作水準(zhǔn)，特別是在面對(duì)復(fù)雜的固狀組織時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)的protocol固然能幫上很大的忙，但是細(xì)致的操作和實(shí)操經(jīng)驗(yàn)更為重要。而擴(kuò)增之后，在基因組中如何選定合適的研究范圍對(duì)于降低成本和提高實(shí)驗(yàn)效率至關(guān)重要。
正是由于單細(xì)胞測(cè)序所要面臨的重重困難，在2013年以前，單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)在全世界范圍內(nèi)只有少數(shù)的實(shí)驗(yàn)室才有應(yīng)用。2013年的時(shí)候，F(xiàn)luidigm公司推出了一款單細(xì)胞RNA測(cè)序自動(dòng)化準(zhǔn)備系統(tǒng)（Single-cell automated prep system for RNA-seq），這一技術(shù)上的突破使得單細(xì)胞測(cè)序變得足夠簡(jiǎn)單，成本也降低了很多，這才使得單細(xì)胞測(cè)序能夠普及開(kāi)來(lái)。同年，單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)榮膺Nature Methods的年度技術(shù)。所以說(shuō)，單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)雖難，但是童鞋們現(xiàn)在上車并不算晚，車才剛開(kāi)沒(méi)一會(huì)。
下面說(shuō)說(shuō)我們到底為什么要做單細(xì)胞測(cè)序，單細(xì)胞測(cè)序到底有哪些應(yīng)用？
前面已經(jīng)提到，同一組織中的細(xì)胞間都是存在異質(zhì)性的，更不必提不同組織、不同系統(tǒng)中細(xì)胞的異質(zhì)性了。這一異質(zhì)性，會(huì)影響我們對(duì)細(xì)胞基因功能認(rèn)知的準(zhǔn)確性。單細(xì)胞測(cè)序能夠幫助我們了解那些難以培養(yǎng)的微生物的基因組功能、了解遺傳鑲嵌功能（Genetic mosaicism）在普通生物學(xué)功能或是疾病發(fā)生中的作用、了解腫瘤內(nèi)在異質(zhì)性對(duì)腫瘤發(fā)展以及耐藥性的影響、重新定義細(xì)胞亞型等等。
左為在單細(xì)胞生物中的應(yīng)用，單細(xì)胞測(cè)序可以幫助我們搜尋稀有（基因組）微生物；右為在多細(xì)胞生物中的應(yīng)用 ，單細(xì)胞測(cè)序可以幫助我們尋找罕見(jiàn)突變，從而了解基因突變和進(jìn)化的信息和其對(duì)應(yīng)的生物學(xué)功能。
單細(xì)胞測(cè)序的應(yīng)用實(shí)例：
1、Single-CellResolutionof TemporalGeneExpressionduring HeartDevelopment （Dev Cell. 2016 Nov 21）
在子宮內(nèi)，心臟最開(kāi)始是一根管，然后是芽珠狀的硬塊，再通過(guò)自動(dòng)折疊然后變成了我們熟知的四腔結(jié)構(gòu)，那么究竟細(xì)胞是如何一步一步進(jìn)行上述程序化的操作的呢？
心臟結(jié)構(gòu)形成過(guò)程
該文作者從小鼠胚胎發(fā)育的七個(gè)不同階段提取心臟細(xì)胞樣本，他們將細(xì)胞分為三類已知的細(xì)胞——心肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，并觀察它們的基因活性隨時(shí)間是如何變化的；他們?cè)谛∈竽Ｐ椭嘘U明了Nkx2.5雜合突變是如何導(dǎo)致先天性心臟缺陷的。心臟細(xì)胞發(fā)育圖譜的構(gòu)建有助于我們了解基因和細(xì)胞的變化是如何導(dǎo)致心臟結(jié)構(gòu)的變化的、基因突變是如何改變每一個(gè)細(xì)胞群成熟的方式以及心臟構(gòu)建過(guò)程中的重要步驟是什么。
2、Decoupling genetics, lineages, and microenvironment in IDH-mutant gliomas by single-cell RNA-seq （Science. 2017 Mar 31）
星形細(xì)胞瘤和少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤都被認(rèn)為是不治之癥，但手術(shù)和放療可明顯延長(zhǎng)生存期。這兩種腫瘤被認(rèn)為是由支持和保護(hù)神經(jīng)元的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的亞型發(fā)育而來(lái)的，但在遺傳學(xué)、外觀和基因表達(dá)方面都有所不同。雖然這兩種類型的腫瘤都含有類似的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，它們也都含有該細(xì)胞類型的標(biāo)記，這就引起了人們對(duì)它們起源于不同類型細(xì)胞這一普遍看法的質(zhì)疑。
實(shí)驗(yàn)流程
該文研究團(tuán)隊(duì)對(duì)10例星形膠質(zhì)瘤樣本中的9800個(gè)細(xì)胞和6例少突膠質(zhì)瘤樣本中的4300個(gè)細(xì)胞進(jìn)行了單細(xì)胞RNA測(cè)序。再結(jié)合癌癥基因組Atlas中的165例轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，研究人員發(fā)現(xiàn)，兩種腫瘤都含有3種癌癥細(xì)胞：非增殖性細(xì)胞、類神經(jīng)干細(xì)胞和祖細(xì)胞。其中的非增殖細(xì)胞被細(xì)分為星形膠質(zhì)細(xì)胞樣和少突膠質(zhì)細(xì)胞樣，利用單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)，作者闡明了這兩種細(xì)胞具有相同的起源，其不同之處主要是遺傳學(xué)差異，以及腫瘤微環(huán)境（如特異性免疫細(xì)胞豐度等）組成不同。
在該研究中，作者觀察到即使在更晚期的腫瘤階段，越是分化的腫瘤細(xì)胞越不容易增殖，這意味著，如果可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞分型，將會(huì)顯著地控制腫瘤生長(zhǎng)。故而作者提出可以使用免疫療法攻擊特定的細(xì)胞類型，從而終止腫瘤的生長(zhǎng)的治療策略。
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